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近兩天， 一則關于“果凍，老酸奶是由破皮鞋做成的”消息在網上瘋傳，因破皮鞋可以提煉出明膠。明膠是一種極為常見的食品添加劑，是從牛、豬等動物骨和皮中的膠原通過變性而制得的變性蛋白質，其化學組成與膠原基本相同，主要成分是膠原蛋白。老酸奶等乳制品為了保持其口感和外觀，會適當添加明膠等食品添加劑，這是國家允許使用的。而皮革制成的明膠透明，無味，消費者根本無法將正規的食用明膠和皮革制成的明膠區分開來。

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如何區分老酸奶等乳制品中添加的是食用明膠還是皮革廢料提煉出來的工業明膠，這一難題一直困擾著廣大分析工作者。迪馬科技獨辟蹊徑，探索是否可以通過檢測皮革水解蛋白來確認老酸奶等乳制品中明膠的來源。皮革水解蛋白是皮革廢料或動物皮毛、臟器等水解生成的一種蛋白粉，對于乳與乳制品中皮革水解蛋白的鑒定，主要是通過對L-羥脯氨酸含量的測定。L-羥脯氨酸是膠原蛋白（皮革水解蛋白）特有的氨基酸，在乳酷蛋白中則沒有，所以一旦檢出，則可認為可能含有皮革水解蛋白，即可判斷該乳制品中有可能含有由廢棄皮革而來的成分。

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迪馬科技實驗室開發了兩種L-羥脯氨酸衍生方法，利用氨基酸分析柱，對L-羥脯氨酸進行分析檢測。該方法檢測結果準確，可靠，方法穩定性好，可用于老酸奶等奶制品中是否含有皮革成分的鑒別，兩種衍生化方法，方便您根據實際情況進行選擇。

以下是老酸奶中L-羥脯氨酸的測定的詳細檢測方法：

老酸奶中L-羥脯氨酸的HPLC測定

1 儀器與試劑

1.1 儀器、器皿

1.1.1 HPLC+紫外檢測器

1.1.2 Diamonsil AAA氨基酸分析柱

1.1.3 11 mL水解瓶

1.1.4 1.5 mL塑料離心管

1.1.5 20 mL玻璃具塞刻度試管

1.1.6 5 mL玻璃具塞刻度試管

1.1.7 0.22 μm針頭式過濾器

1.1.8 2 mL樣品瓶

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1.2 試劑

1.2.1 甲醇

1.2.2 乙腈

1.2.3 正己烷

1.2.3 三乙胺

1.2.4 冰醋酸

1.2.5 磷酸氫二鈉

1.2.6 磷酸二氫鈉

1.2.7 L-羥脯氨酸

1.2.8 蛋白水解試劑：稱取0.1 g苯酚置于100 mL容量瓶，加入50 mL濃鹽酸（36%-38%，摩爾濃度約為12 mol/L），然后加水定容至100 mL。

1.2.9 ?0.1 mol/L HCl水溶液：量取8.3 mL濃鹽酸，然后用純水定容至1000 mL。

1.2.10 衍生劑PITC溶液：將250 μL異硫氰酸苯酯（PITC）用乙腈定容至10 mL。

1.2.11 三乙胺溶液：將1.4 mL三乙胺用乙腈定容至10 mL。

1.2.12 衍生劑DNFB溶液：0.5 mL 2,4-二硝基氟苯（DNFB）溶于50 mL乙腈。

1.2.13 Na₂B₄O₇緩沖溶液：稱取1.91 g Na₂B₄O₇·10 H₂O，用50 mL純水溶解。

1.2.14 氨基酸儲備液：稱取一定量L-羥脯氨酸，用0.1 mol/L HCl水溶液溶解，得到濃度為? 0.05 mol/L的儲備溶液。

1.2.15 氨基酸使用液：將儲備液用0.1 mol/L HCl水溶液稀釋，得到濃度為0.0003 mol/L的L-羥脯氨酸溶液。

1.2.16 磷酸鹽緩沖溶液：0.02 mol/L Na₂HPO₄ 和NaH₂PO₄水溶液。

2 實驗方法

2.1 樣品水解

(1)??? 稱取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中（1.1.3），加入蛋白水解試劑（1.2.8），旋緊蓋子，振蕩混勻，110 °C下反應24 h。

(2)??? 反應完畢，將反應液全部轉移至100 mL蒸餾瓶中，75℃下減壓蒸餾至近干。

(3)??? 用12 mL0.1 mol/L HCl水溶液（1.2.9）分三次溶解殘渣，并轉移到20 mL玻璃具塞刻度試管（1.1.5），再用純水定容至20 mL，待衍生。

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2.2 樣品衍生

2.2.1 異硫氰酸苯酯（PITC）衍生方法

（1）樣品水解溶液衍生

量取200 μL樣品水解溶液，置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL三乙胺溶液（1.2.11）和100 μL衍生劑PITC溶液（1.2.10），混勻，室溫反應1h，加入400μL正己烷（1.2.3），旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合，經0.22 μm針式過濾器（1.1.7）過濾，待分析。

（2） 標準溶液衍生化

量取200 μL L-羥脯氨酸使用液*（1.2.15），置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL三乙胺溶液（1.2.11）和100 μL衍生劑PITC溶液（1.2.10），混勻，室溫反應1h，加入正己烷400 μL（1.2.3），旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合，經0.22 μm針式過濾器（1.1.7）過濾，待分析。

*根據實際情況，氨基酸使用液濃度可進行調整，本方法中氨基酸使用液濃度僅供參考。

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2.2.2 ?2,4-二硝基氟苯（DNFB）衍生方法

（1） 樣品溶液衍生

取0.5 mL樣品水解溶液置于5 mL玻璃具塞刻度試管（1.1.6）中，加入0.5 mL Na₂B₄O₇緩沖溶液（1.2.13）和0.5 mL衍生劑DNFB溶液（1.2.12），具塞搖勻，于60 °C下避光反應1 h。反應完畢將試管置于冷水中冷卻，用磷酸鹽緩沖溶液（1.2.16）定容至5 mL，混勻后經0.22 μm針式過濾器（1.1.7）過濾，待分析。

（2） 標準溶液衍生

取0.5 mL L-羥脯氨酸使用液（1.2.15）置于5 mL玻璃具塞刻度試管（1.1.6）中，加入0.5 mL Na₂B₄O₇緩沖溶液（1.2.13）和0.5 mL衍生劑DNFB溶液（1.2.12），具塞搖勻，于60 °C下避光反應1 h。反應完畢將試管置于冷水中冷卻，用磷酸鹽緩沖溶液（1.2.16）定容至5 mL，混勻后經0.22 μm針式過濾器（1.1.7）過濾，待分析。

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