作者：趙慧娟

摘要：中藥藥動學研究是中藥走向現代化之路的重要途徑,但這一直是中藥現代化的瓶頸之一,大多數中藥在體內的代謝尚不清楚,致使其臨床應用缺乏科學依據,從而影響療效或引起不良反應。藥物不良反應多由藥物相互作用引起,而代謝性相互作用的發生率最高。?藥物代謝主要依賴于肝臟中的細胞色素P450混合功能氧化酶系(cytochromeP450,CYP450)。CYP介導的藥物相互作用主要為酶誘導和酶抑制,酶抑制是引起藥物相互作用的重要原因。近年來,有關中藥引起的藥物相互作用逐漸受到重視。臨床上中藥的主要應用形式是復方制劑。當多種藥物聯合應用時,就很容易出現不良反應。由于中藥組成的復雜性,由中藥引起的相互作用機制尚不清楚。因此,研究中藥對CYP450的影響就顯得非常具有實際意義。?研究目的?本論文擬采用體外實驗,研究燈盞細辛注射液等37種中藥及其主要有效成分對大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19的影響,初步篩選出對這三種酶有抑制作用的中藥;采用動物體內實驗進一步確證香丹注射液、血塞通注射液和銀黃口服液對大鼠CYP2C19的抑制作用,從而為確定細胞色素P450酶(CYP450)在中藥代謝中的作用,闡明中藥對大鼠CYP450的作用,豐富中醫基礎理論、預測藥物相互作用和中藥的安全性評價以及指導臨床合理用藥提供依據。?研究方法?1.體外篩選對大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19有抑制作用的中藥?1.1大鼠肝微粒體制備取肝臟采用鈣沉淀法制備肝微粒體。?1.2肝微粒體蛋白含量測定Bradford法測定肝微粒體蛋白含量。?1.3孵育反應實驗分實驗組和對照組,實驗組中加入中藥,對照組加入等體積的磷酸鹽緩沖液。孵育體系總體積CYP2D6為500μl,CYP1A2和CYP2C19為200μl。反應體系中包含NADPH,磷酸鹽緩沖液,EDTA,MgCl_2,微粒體蛋白和相應的探針藥物(分別是氫溴酸右美沙芬,非那西丁,奧美拉唑)。?1.4酶活性測定以探針藥物的轉化程度作為酶活性的指標。?1.5探針藥物方法學考察建立測定大鼠肝微粒體中氫溴酸右美沙芬、非那西丁和奧美拉唑的HPLC法,并按生物樣品的測定要求,對方法的專屬性、靈敏度、精密度、穩定性、回收率和線性范圍等進行考察。?1.6肝微粒體蛋白濃度和孵育時間對探針藥物代謝的影響分別設定不同的肝微粒體蛋白濃度和孵育時間,考察與探針藥物代謝的關系,確定最佳蛋白濃度和孵育時間。分別確定0.75mg·ml~(-1)、0.75mg·ml~(-1)、0.20mg·ml~(-1)和40min、30min、20min作為CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19孵育體系的肝微粒體蛋白濃度和孵育時間。?2.血塞通注射液、香丹注射液和銀黃口服液對大鼠CYP2C19的抑制作用?2.1給藥方案按照隨機對照原則,血塞通注射液、香丹注射液、銀黃口服液分別設立實驗組和對照組,每組10只雄性SD大鼠,實驗組分別給予血塞通注射液(4.17ml·kg~(-1))、香丹注射液(10.42ml·kg~(-1))、銀黃口服液(31.25ml·kg~(-1)),對照組分別給予相應等體積的生理鹽水。連續給藥7天。?2.2肝微粒體制備及蛋白含量測定末次給藥后24小時斷頭處死大鼠,取肝臟采用鈣沉淀法制備肝微粒體,Bradford法測定肝微粒體蛋白含量。?2.3孵育反應孵育體系包含NADPH,磷酸鹽緩沖液,EDTA,MgCl_2,微粒體蛋白和奧美拉唑。?2.4色譜條件色譜柱5μm?DiamonsiL?C18柱(4.6mm×200mm),流動相為甲醇:乙腈:0.1mol·L~(-1)乙酸銨溶液=10:35:55,流速1.0ml·min~(-1),檢測波長302nm,柱溫25℃,進樣量30μl。?2.5酶活性測定采用高效液相色譜法(HPLC)測定奧美拉唑的濃度,以奧美拉唑的轉化程度(TR)作為酶活性的指標。?3.統計分析運用SPSS10.0統計軟件進行數據分析,所有數據均以平均值±標準差((?)±S)表示,采用獨立樣本t檢驗分析兩組間酶的活性差異。a=0.05作為檢驗水準。?結果?1.體外篩選對大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19有抑制作用的中藥?1.1探針藥物方法學考察肝微粒體樣品中雜質不干擾氫溴酸右美沙芬、非那西丁、奧美拉唑的測定,日內和日間變異系數均小于15%,肝微粒體中探針藥物的線性范圍分別為5.0～160.0μmol·L~(-1)、6.25～200.0μmol·L~(-1)、1.0～32.0μmol·L~(-1),標準曲線的相關系數分別為0.9994、0.9996、0.9998;樣品處理簡單快速,方法的靈敏度、重現性、穩定性和精密度均達到生物樣品的分析要求。?1.2對大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19有抑制作用的中藥通過體外實驗,從37種中藥中篩選出血塞通注射液、清開靈注射液、銀黃口服液、藍芩口服液4種中藥對CYP2D6酶的活性有顯著抑制作用(P＜0.05);清開靈注射液、茵梔黃注射液、穿心蓮注射液3種中藥對CYP1A2酶的活性有顯著抑制作用(P＜0.05);茵梔黃注射液、香丹注射液、雙黃連注射液、穿心蓮注射液、血塞通注射液、銀黃口服液6種中藥對CYP2C19酶的活性有顯著抑制作用(P＜0.05)。?1.3中藥對大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19的IC_(50)血塞通注射液、清開靈注射液、銀黃口服液、藍芩口服液對CYP2D6酶的IC_(50)分別為0.99ml·100ml-1、0.65ml·100ml-1、0.15ml·100ml-1、0.14ml·100ml-1;清開靈注射液、茵梔黃注射液、穿心蓮注射液對CYP1A2酶的IC_(50)分別為3.55ml·100ml-1、2.43ml·100ml-1、2.49ml·100ml-1;茵梔黃注射液、香丹注射液、雙黃連注射液、穿心蓮注射液、血塞通注射液、銀黃口服液對CYP2C19酶的IC_(50)分別為0.67ml·100ml-1、0.64ml·100ml-1、0.90ml·100ml-1、0.81ml·100ml-1、0.75ml·100ml-1、0.056ml·100ml-1。上述中藥對CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19酶的抑制作用呈濃度依賴性。?1.4中藥與其有效成分的比較清開靈注射液與其主要有效成分(黃芩苷+梔子苷)對CYP2D6的抑制作用無顯著差別(P＞0.05)。銀黃口服液和藍芩口服液對大鼠CYP2D6的抑制作用顯著強于其相應主要有效成分(分別為黃芩苷和梔子苷)(P＜0.05);茵梔黃注射液、清開靈注射液、穿心蓮注射液與其相應有效成分(分別為黃芩苷+梔子苷、黃芩苷+梔子苷、穿心蓮內酯)對大鼠CYP1A2的抑制作用和茵梔黃注射液、雙黃連注射液、銀黃口服液、血塞通注射液與其相應有效成分(分別為黃芩苷+梔子苷、黃芩苷、黃芩苷、三七總皂苷)對大鼠CYP2C19的抑制作用均無顯著差別(P＞0.05)。?2.血塞通注射液、香丹注射液和銀黃口服液對大鼠CYP2C19的抑制作用靜脈注射血塞通注射液對大鼠CYP2C19有顯著抑制作用(P＜0.01),靜脈注射香丹注射液和灌胃給予銀黃口服液對大鼠CYP2C19均無顯著抑制作用(P＞0.05)。?結論:?1.血塞通注射液、清開靈注射液、銀黃口服液、藍芩口服液體外對大鼠CYP2D6酶活性有顯著抑制作用;清開靈注射液、茵梔黃注射液、穿心蓮注射液體外對大鼠CYP1A2酶活性有顯著抑制作用;茵梔黃注射液、血塞通注射液、香丹注射液、雙黃連注射液、銀黃口服液、穿心蓮注射液在體外對大鼠CYP2C19酶活性有顯著抑制作用,且上述中藥對CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19的抑制作用呈濃度依賴關系。?2.清開靈注射液等中藥與其相應有效成分對大鼠CYP450酶的抑制作用有的有顯著差別,有的無顯著差別。?3.在大鼠體內,血塞通注射液對大鼠CYP2C19有顯著抑制作用,香丹注射液和銀黃口服液對大鼠CYP2C19無顯著抑制作用。

譜圖：

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